この2年間のコロナウイルスによる厄災を振り返ると、色々の記憶が重なって感慨深い。自粛のストレスや、経済の沈静化、緊急事態宣言など暗いニュースの中で、マスコミの報道がやたら騒がしかった。武漢での感染発生から始まり、ダイヤモンドプリンセス号、世界での惨状、PCR騒ぎ、コロナ治療薬、新型ワクチンの副作用、ワクチン接種の実施、コロナと五輪をネタにした政治闘争、そして、今後は国産ワクチンの開発をどうするかなどへ続くだろう。話題は次々に登場し、踊り、消えてゆくのであるが、mRNAワクチンの製造技術は、未知の新型ウイルスに対しても短時間で対処できるうえに、抗がん剤などへ応用できるうえに、国防上も非常に重要であるので、この国の根幹にかかわる技術として、是非、根付かせたいものである。そんなことで、老生もこの問題から目を離すわけにも行かず、25話から30話まで6話も続けてコロナに関するエッセイを書くことになってしまったが、これを最後としたい。
最初の25話から、「感染を避けながら、経済と医療体制をキープし、ワクチンができるのを待つしかない」と言ってきたのだったが、ついに、その期待のワクチンを接種してもらった。ファイザー社のワクチンだった。まさか、昔、苦労して発見したmRNAキャップを、―――体内へ打ち込んでもらうなどーーー思いもよらないことであったが余りにも投与量 (0.3 ml) が少ないのと、筋肉注射が痛くないことで、特段の感慨もなく、2回目の接種もアッという間もなく過ぎてしまった。
モデルナ社のmRNAワクチン製造を探偵する
同じ日、モデルナ社のmRNAワクチンの製造と販売が、医薬品機構 (PMDA) から承認されて、その申請書が公開されているので読んでみたが、これがひどい。申請書は、武田薬品と機構との合意で作られたようだが、黒く塗りつぶされた部分が多くてmRNAワクチンがどうやって作られたのか「わからない」ようにしてある。新しい医薬品の製造・販売の承認文書の公開って、一体何なんだろう？「このような新しい医薬品が、このような審査の末、承認されました」ということの、国民への告知ではないのか？私のような薬学者が読んでも判らないようにしてある公開文書を、形式的にだすPMDAの体質は何なんだろう。一体、どこを向いているのだろうか？海外での臨床試験のデータは、論文発表もしてあるので、これは隠すわけにはゆかないらしく、無修正で翻訳して残してある。mRNAワクチンの開発に遅れをとった日本の政府機関と製薬会社が、合意の上で、最先端の医薬品の製造方法を同業他社に見せないようにしているーーーそんな風景としか思えない。そんな体質だから、世界の新薬開発に後れを取り、毎年、数兆円に近い医薬品の輸入超過を続けることになるのだろうと思わざるをえない。自動車の輸出で稼いだ分を医薬品で擦っているとしか思えない。PMDAには猛省を促したい。ファイザーの申請書にも黒塗り部分はあったが、限定的で、おおらかで、いろんなことがわかったが、武田薬品の申請書はーーーひた隠しに隠しているようでーーー“みみっちい”と言わざるを得ない。mRNAワクチンの全体構造は、キャップを入れ、N1メチルシュードウリジンを使ったりしていることなど、ファイザーのものと、同じであるが、黒塗りの裏を探偵してみると、どうやらmRNAの頭の部分のキャップの付け方に違いがあるようである。
ファイザーのワクチンは、(m7, m3’-O)Gppp(m2’-O)ApGで始まり、作り方の概要は、第29話で紹介したレシピで示してある。他方、モデルナのワクチンの製造法は色々隠してあり、わからないようにしてあるのだが、消し忘れてある試薬名から謎が解けてきた。申請書には、天然型キャップと書いてあるから、このmRNAにはm7Gppp(m2’-O)ApGが付いているのだろうと想像できる。ーーーであれば、ファイザーのmRNAキャップとは、キャップ構造の細部で違う。多分、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素2種類を使った、Post-transcriptional な酵素反応によってつくったものであろうーーーそんな製造方法が黒塗りの㊙のなかに隠されているのだと思われる。この方法では、高価な2種類の酵素とメチル化試薬のSAM (S-adenosylmethionine) を使うから、「ファイザー風mRNAワクチン」よりコストも手間もかかるはずだ。それだから、モデルナワクチンは、ファイザーより10ドルほど高くなり、1回分が30ドル台になるのであろう。この「モデルナ風mRNAワクチン」のレシピは後ほど作ってみたい。
キャップの付け方が違う
ファイザーとモデルナでは、mRNAワクチンの頭の部分のキャップに違いがあるようだが、キャップの違いによってどちらがタンパク合成において優れたmRNAであるかについては詮索しないでおきたい。老生はあまり違わないだろうと見ている。日本ではこれから、研究試薬として、mRNAワクチンの作成が、あちこちの大学やベンチャーや製薬会社の研究室で始まるであろう。キャップを付ける方法は2種類あって、それは、Co-transcriptional capping とPost-transcriptional cappingという言葉で区別されることを述べておきたい。―――この区別は、ハッキリ言って老生 (国立遺伝研―米国ロシュ分子生物学研究所) とバーニー・モス博士 (Berny Moss、NIH) との40年間の宿年のライバル関係にある違いでもある。言っておくが、バーニーと私は親しい友人であり、彼は現在86歳―――彼は、まだ、NIHに研究室を持ち、フロリダからテレワークで研究を楽しんでいる。以下は、多少、専門的になるので青字で区別して書くことにする。
Co-transcriptional capping
キャップの発見は、昔、国立遺伝学研究所で、老生が三浦謹一郎先生と蚕細胞質多角体ウイルスの研究をやっていた時、メチル化ドナーであるSAMを転写系に入れるとmRNA合成が始まることを見つけたのが最初のきっかけだった。メチル化されたキャップは、転写のごく初期に (10塩基以内の短いオリゴヌクレオチドの時点で) 作られていた。つまりSAMとメチル化酵素は「転写開始の鍵」のような働きもするらしいのである。いまや、mRNA学の元祖とも言われるロックフェラー大のダーネル教授と一緒にやった実験でも、核内のアデノウイルスや宿主ヒト細胞のmRNAの前駆体 (hnRNA) は、出来たばかりの短いオリゴRNAの段階で、すでにキャップ構造はできていたからーーーキャッピングは、転写の初期段階で起こるーーーと提唱してきた。すなわち、RNAポリメラーゼはm7Gを作るグアニリルN7メチルトランスフェラーゼと連動して、mRNA合成の開始とキャッピング (とメチル化) を同時に行うという仮説である。後に、蛋白質の立体構造を明らかにする技術が開発されて、RNAポリメラーゼ (Pol-II) とメチルトランスフェラーゼは一つの複合体の中にあることが証明されていて、この仮説を裏付けるものだった。このタイプのキャッピングは、Co-transcriptional cappingと言われている。老生はこの呼び方が中途半端なので、概念としては「Pre-transcriptional capping」とか、「Methylation-coupled transcription」であると主張してきた。インフルエンザウイルスのｍRNA合成が、キャップがなければ起こらないように、Capping と転写開始は連動していると思われる。ファイザーのmRNAワクチンはこの仮説に添うように、キャップオリゴマー (TriLink社製) をプライマーとして使ってmRNAの製造が行われる。
キャップ生合成メカニズム
mRNAの合成に伴うキャッピングは、以下のプロセスで進む (図1)。この工程は1976年に老生が見出して提唱したもので、すでに教科書に取り入れられて定説になっている。4工程の酵素反応からなっていて4種の酵素と1分子のGTPと2分子のSAMを必要とする。モデルナ社のmRNAキャップは、多分、このようにしてT7によるRNA合成中にワクシニアのキャッピング酵素とGTPとSAMを加えて作られているはずだ。最初にpppApG (図ではpppNpN) がポリメラーゼにより作られ、リン酸が1個除かれてppApGとなる。ここへGTP(pppG)の中のpG部分が結合し、GpppApG (図ではGpppNpN) ができる。そして、その次に左側のGpの7位へメチル基が入りキャップ中最も重要なm7Gができてm7GpppApGとなる。ここまでの連続的な反応は全てワクシニアのキャッピング酵素がやってくれるのであり、便利だ。バーニーのお手柄でもある。2種類の蛋白質複合体から成るワクシニアのキャッピング酵素には、ここまでの3行程を行う3種類の酵素が含まれている。最後に、m7GpppApGのAp部分のリボースへメチル基を入れる別の酵素2'-O-methyltransferaseがm7GpppApGに働き、m7GpppAｍpGが完成する。この最後の2'-O-methyltransferaseは、先に作られたm7Gに依存的だから、気を付けなくてはならない。
図1．ｍRNAへキャップを付ける4段階の酵素反応
4行程の反応プロセスを行う4種類の酵素。ワクシニアキャッピング酵素標品 (市販) は最初の3行程を行う活性を含む。最後の2'-O-メチル化を行う2'-O-methylteansferase (市販) は単一酵素。基質として、1分子のmRNAワクチンに対して、1分子のGTPと2分子のSAMを必要とする。図は、Furuichi, Y. (2015) Proc. Jpn. Acad. Ser. B Vol. 91より転載。
Post-transcriptional capping
米国NIHのバーニーの研究室は、酵素研究が上手だ。SAMを入れると蚕CPVウイルスのmRNA合成が開始してmRNAがメチル化されるという私の大発見トピックスを、論文の査読中に知ったのだと思うが、このSAMの効果を、彼はワクシニアウイルスの転写系で試してみた。その結果、ワクシニアのmRNAはメチル化されていることを確認し、私が米国へ留学するのに手間取っている間に、まんまとキャップ構造を解明し、1975年の1月号のPNASで発表した。この雑誌の同じ号では、私と留学先上司のShatkin博士と作ったヒト・レオウイルスのキャップ構造の論文が、きわどく数日間の先行受付で載っているので、研究競争で負けたわけではないがーーー本当にきわどかった。米国渡航の前に、投稿していた古市・三浦のNature論文も1月に出ていて、三浦先生との論文も、バーニーには負けはしなかったが、本当に危なかった。彼は、ウイルス粒子をDetergentで可溶化して、その中にあるキャッピング酵素やメチル化酵素を分別して精製することに成功した。それらの酵素は、その後、試薬として売られ、永くRNA研究で使われてきた。ワクシニアのキャッピング酵素やメチル化酵素は優秀で、pppNpN-―――のRNAに、後からでもキャップを付けることが出来る。そんな酵素を持っているから、バーニーはPost-transcriptional cappingを提唱するのであるが、酵素生化学の問題と、細胞生物学の問題を、同じまな板の上に載せて議論するようで決着はつかない。後年、バーニーが奥さんを連れて来日した折、1日、鎌倉へ誘った。小町通りの日本食で3人で昔話と夕食を楽しんでいたのだが、我々の話を傍で聞いていた奥さんが「えっ、あんた達、永い間のライバルだったの？もうやめなさいよ」と言ったのは可笑しかった。
さて、モデルナのmRNAワクチンは、T7ポリメラーゼで作ったpppApG---RNAへ、SAMとキャッピング酵素を加えて、その末端をm7Gppp(m2’-O)ApGに変えるのであろうが、RNA合成中にCo-transcriptional反応で、それが同時にできれば、工程数を減らすことが出来るであろう。
モデルナ風ワクチンｍRNAのレシピ
29話のファイザー・ビオンテクmRNAワクチンのレシピに続き、モデルナワクチンの芯の部分 (コードネームmRNA1279) の作成レシピについて紹介したい。これは老生が昔のやり方を思い出しつつ恣意的に作ったものなので、諸兄姉には、さらなる工夫を凝らして作ってみられたい。二つのレシピは、UTPに替えてハンガリー出身の女性研究者Katalin Kariko博士とDrew Weissman博士が、細胞性免疫を避けるために使ったシュードウリジンN-1-methyl ΨTPを使っている。
この後、不要になったDNAをDNaseで分解し、低分子ヌクレオチドを除去するなどして、mRNAを精製する。なお、RNAのキャッピングがうまくいってない場合にも、くじけてはいけない。T7ポリメラーゼによって合成されたRNAを一度単離・精製して、1 mlの1X 転写反応液に再溶解し、GTP 1 mM、並びにSAM 1 mMとワクシニアキャッピング酵素や2'-O-methyl transferase を加えて、こんどは、実際にPost-transcriptional capping反応を行わせることが出来よう。
mRNA・LNPの製剤化
次に、mRNAワクチンの製剤は、4種類の脂質混合液とミックスすることによりmRNA/LNPサスペンジョンを作り、筋肉注射剤とするのであるが、この工程には製薬会社のノウハウ部分があるので不明なところが多い。4種類の脂質とは、コレステロール、DSPC、(黒塗り部分の、多分カチオン性脂質の) SM102、ならびにPEG-2000である。これらの脂質間の混合比やmRNAとの混合比は㊙であり、製剤サスペンジョンの粒子径や安定性、さらには注射時のアナフィラキシーショックの原因にもかかわる重要なノウハウである。脂質の希アルコール溶液をmRNAと混合し、その後、アルコールを限外ろ過して除き、安定な酢酸緩衝液・サスペンジョンとするのであろうが詳細については不明である。これらのことの多くは㊙事項であるが、興味のあるところでもある。
新規サーキュラーmRNAワクチン
それでは、今後のmRNAワクチンの開発は、現在の基本技術で頂点に達したのであろうか。いやそうではなさそうだ。現在のmRNAワクチンは直鎖状の一本鎖RNAだが、これに関する特許などを全て回避した形のサーキュラー (環状) RNAが考えられている。これを開発しようとする新ベンチャーLaronde (ラロンデ) が米国で作られていて、巨額の資金が投下されている (https://cen.acs.org/のニュース記事より)。Larondeは、フランス語で、“丸い”という意味だそうだ。そんな丸い構造のRNAをeRNA (endless RNA) と呼ぶそうで、eRNAにはキャップが入る余地がない。
また末端がないことから、多分、細胞性免疫を避けることが出来るので、N-1-methyl ΨTPの必要も無くなるかもしれないし、エキソヌクレアーゼによる攻撃も受けないので細胞内では安定かもしれない。さて、そうなると、蛋白合成に必要なキャップがないので、リボソームが結合するサイトをRNA中に設置しなければならないのであるが、それには、このエッセイシリーズの第7話で紹介したポリオウイルスが細胞に侵入した時にーーーキャップ非依存的なタンパク合成の際に使うーーーIRESと呼ばれる特殊な二次構造を作る配列 (Internal Ribosome Entering Sequence) を組み込んで使うことになろう。IRESは、現カナダMcGill大の教授のジェリー・ペレティア (Jerry Pelletier) とナフム・ソネンバーグが1988年に発表した構造156でーーー「キャップを持たないポリオウイルスのmRNAはどうしてタンパク合成を行えるのだろう？」というーーー素朴な好奇心から発して見つけたRNA構造であり、実は、ポリオウイルスの感染などとは関係のない植物細胞の中でも働ける普遍的なRNA構造である。そんなeRNAには、キャップもポリAもないが、そのIRES構造の後ろにはKozak配列を含む「開始コドン」があり、蛋白質をコードするORFが続き、その後ろには「終止コドン」がきて、そのあと、ぐるりと回ってまたIRES へつながるという構造である。IRESを介して結合したリボソームはeRNAから離れることなく何度も効率よくタンパクを作り続けることが出来るであろう (図2)。老生は、先に、これからのワクチンは分子生物学mRNAワクチンと喝破したが、eRNAは、多くの先人が残した功績を組み入れた第2のメッセンジャーRNA医薬になると期待されるのであり、皆さんの活躍を期待したい。
図2．想定される環状mRNAワクチンの構造
赤で記したIRESはリボソームのエントリーサイトであり、実際の構造については「ポリオmRNAに関する発見とIRES」(第7話) を参考にされたい。図はhttps://cen.acs.org/のニュース記事からの転載。
おわりに
RNA医薬への興隆へ
RNAを素材とする医薬品にはsiRNA、マイクロRNA (miRNA)、アンチセンスオリゴ (ASO)、アプタマーなどがあるが、近年、mRNAがその舞台の主役を務めるようになったと思われる。mRNAの医薬品化は、我々RNA研究者の夢であったが、技術的な壁とデータ不足に阻まれて、その実現は遅々としていた。しかしながら、コロナウイルスのパンデミックを奇貨として、緊急医薬のニーズから、mRNAワクチンが良い先例となりーーー世界何億人もの被検者からの、安全性などに関する豊富な臨床データに恵まれるなどしてーーーmRNAの医薬品化が奔流のようにスタートしたことに拍手を贈るものである。mRNAワクチンの臨床応用は、壮大ではあるものの、わずか2年間足らずの応用であり、いまだ最終結論を得たものではないが、我々が知る分子生物学的や免疫学の観点からみると、最先端科学を担保にした、安全で、副作用も少ない、理想的なワクチンであると思える。
3回目のワクチン接種もmRNAワクチンなら可能
変幻自在な難敵コロナウイルスに対してーーー年一回定期的な、合計3回以上の接種も必要になるかもしれないがーーーmRNAワクチンなら、先に紹介したレシピに従って容易にこれに対応することが出来るし、迅速に、新しい抗原配列に対するワクチンを調製することもできよう。感染症対策のためのワクチンだけではなく、抗がん剤など第29話に述べたような通常の病気への医薬品に対してもmRNA医薬は適用できそうなポテンシャルを有している。
理解不足によるガセネタ
しかしながら、RNAをDNAと取り違えた誤った理解から、あるいは「狼怖い」的なネガティブニュースが好きなメディアや、テレビのワイドショウによって、昨今、心無いデマ情報が拡散され、ワクチン回避の原因になろうとしているのは、誠に残念である。
アデノウイルスをベクターとするDNAワクチンでは、核内でmRNAが作られるため、RNAの配列次第では不必要なスプライシングが核内で起こり、その結果、mRNAの3'側にあるべき、膜アンカー領域が除かれたmRNAが作られてしまい、「細胞膜上に固定できないスパイク蛋白」ができてしまうということが指摘されている。この場合、悪玉のアンカーフリーになったスパイク・フラグメントは、血流に乗り微小血管へ運ばれ、ACE2レセプターを持つ細胞を殺し、その死骸と炎症反応で、例えば脳血栓症を起こす可能性が考えられる。しかしながら、これはDNAワクチンの場合であり、細胞質にとどまるタイプのーーーmRNAワクチンでは、そのようなことは起こりえないーーーそんな理屈は、この稿の読者には理解して頂けるものと思う。不毛で有害なフェークは、そのようなRNAとDNAの違いや、核の内外 (うちそと) の違いを理解できない著名な医科学者人の言葉を「切り取って」作られている場合が多いので、RNA学会員の皆さんには、是非、周囲への正しい理解の啓蒙をお願いしたく思う次第である。
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