発明・発見の糸口というのは思わぬところから得られることが多い。細い糸の流れは、次々に合流し、大きな流れに育ち、新しい概念の発見に至るということになるのであり、ゲノムコードの解読は、まさにそれだった。1961年の「ニーレンバーグとマテイのポリＵ/フェニールアラニン実験」以来UUUとPheの関係がわかりーーーそのほか、PNPaseの逆反応で作られるPolyAや PolyCを使ってーーーリジン (Lys/AAA) やプロリン (Pro/CCC) などのコードを予想するデータはあったが、それでも限界があり、障壁にぶつかっていた。そんな時、キッカケを作ったのは、日本からの論文、転移RNA (tRNA) とリボソーム (Ribosome) の結合実験だった。
ゲノムコード解読のキッカケ：高浪満博士のtRNA／リボソーム結合実験
1960年頃から、東京国分寺にある家畜衛生試験場で、研究員の高浪満博士は、大腸菌をすり潰した無細胞抽出液の中で、tRNAに結合した放射性アミノ酸が、リボソームへ渡されてーーー つまり転移してーーータンパク質内へ入ることを見出していた。これは大発見だった。高浪博士は、放射性tRNAを作り、この反応を詳しく調べてみると、tRNAは、アミノ酸をつけていても、いなくても（――Mg++濃度にもよるがーー）、リボソームへ結合することを見つけ、当時の人気ジャーナルだったBBA誌へ、シングルネームで、この間の詳しい分析を、次々と、実に4報も、報告していた113。この時代は、リボソームが何をしているのかも判らず、ペプチド合成の方向が、Ｎ末からＣ末へ進むのか、あるいはその逆なのかさえも判らず、メッセンジャーRNA (mRNA) も、5’->3’の方向に読まれるのか、あるいはその逆なのか、そのほか、ぺプチジルtRNAなどという概念もない、まさに「闇夜で手探り状態」だったのである。そんな時に、高浪博士の「tRNAがリボソームに結合する」という詳しい分析データが、日本から次々発信された。非常に残念だったのは、高浪博士がーーー後に京都大学化学研究所へ移られるがーーーもし、高浪博士がPolyUをこの無細胞抽出液へ入れていたら、実験は、超大発見に変身し、ニレンバーグと並んでストックホルムへ行くことになっていたかもしれない。
しかし、現実は悔しい。この時、PNPaseで作るPolyUは、米国にはあったが、日本にはなかった。また、第18話で紹介したようにPNPaseを精製するために、筆者が夜汽車に乗って大阪大学の次田先生のところへ、産生バクテリアをもらいに行ったのは、この数年後のことなのである。また、PNPaseでPolyUを合成するにしても、日本では、基質UDPも自分で合成しなければならない貧しい時代だったから、到底、無理だったであろう。そんな中でも、高浪先生のこの重要な発見は、確実に、世界中へ知られることになった。
そして、このあと、―――雨後に、竹の子が増えるようにーーー米国の各地から、tRNAとリボソームの結合反応を調べた論文発表が増える。たとえば、PolyUを加えるとフェニールアラニルtRNAのリボソームへの結合が増えるという現象である。たとえば、この頃、たまたまニーレンバーグの近くにいて、後にペンシルバニア大学で研究室を持たれる梶昭・日出子ご夫婦は、このタイプの実験を行った最初のグループである114。残念なことには、そのPolyUを短くしてーーー例えばpUpUpUなどのーーーPhe-tRNAのリボソームへの結合を調べて欲しかったなと思うことであり、梶先生は東大薬の先輩にあたるので、特に残念に思う次第である。この稿を書いていて気が付いたのだが、このあたりから日本人研究者の活躍が始まっている。太平洋戦争での敗戦で焦土となり、「―――あの国は、もう再生できなくなったのではーーー」と思われた日本から、僅か15年後には若い日本人研究者が、米国で、遺伝子のDecodingという生物学の歴史の大きなうねりの波の中で、第一線で活躍しているのを見るのは感動である。ここには、最近の論文上で横溢する、中国系の名前は一切ない。そんな中、ニューヨーク大のオチョア研究室に留学されていた筆者の恩師でもある故上代淑人先生が、ランダムPolyUCなどを作って、在米の皆さんに配布しているのを、論文中に見かけることがあるが、―――なるほどなあーーー、上代先生の人柄と、同胞をつなぐネットワークがあったことを知って嬉しくなるのである。
ニレンバーグとリーダー（Marshal Nirenberg and Philip Leder）
高浪博士の地道なtRNA/リボソームの結合研究に引き続き、アミノ酸をつけたtRNA (AA-tRNA) は、特定のRNAを搭載したリボソームへ強く結合することがわかった。このタイプの研究の中で群を抜いた論文は、1964年、ニレンバーグとリーダーがPNAS (6月) と Science誌 (9月) に発表した論文である115,116。なかでもScience 論文は圧巻であった。 彼らはPolyUなど長いRNAではなく、PNPaseで作ったRNAを分解し、そこで得られた小さなオリゴヌクレオチド (トリプレット) を濾紙クロマトグラフィーで分別・精製し、そのトリプレット (pUUUなど) をリボソームへ加えて結合させ、アミノ酸をつけた放射性AA-tRNA (14C-Phe-tRNAなど) がリボソームに結合するかを測定したのである (図1)。
図1：放射性14C-Phe-tRNA の大腸菌リボソームへの結合
PolyU や(pU)3トリプレットの存在でPhe-tRNAがリボソームへ結合する。(pU)2やマイナステンプレート (No addition) では結合は少ない。
ここで、長さの異なるオリゴを試してみると、3個の塩基を持つトリプレットが結合の最小単位であることがわかった。そして、「AA-tRNA・トリプレット・リボソーム」よりなる3者複合体は、ミリポアフィルターでトラップされるが、結合しないAA-tRNA はフィルターを素通りする現象を利用して、「どのアミノ酸をつけたtRNAが、どのトリプレットを介してリポソームへ結合するか」が、簡便に判り、アミノ酸とトリプレットコードの暗号解析は加速度的に進み、現在我々がみるコード表の大部分が解明された (表1)。
表1：ニーレンバーグらのAA-tRNAのリボソーム結合実験から予想されたゲノムコード（1964115）
このScience論文は、1961年のニーレンバーグ・マテイに継ぐインパクトの大きい論文であるが、ニーレンバーグとリーダーは、この論文中で、高浪論文を最初にサイトしている。この発見のキッカケを与えた高浪論文に対して大きな尊敬を払ったのだと思わざるを得ない。この当時、八王子の田舎 (失礼！) でコツコツやっていた高浪先生と、米国NIHで大グループを率いて最先端を走っていたニーレンバーグの研究室の間に直接の交流があったとは思えないが、高浪先生を知る筆者としては―――研究者の仁義が、ここでフェアに示されているのを見てーーー嬉しく思う次第である。後になってしまったが、これらの実験から、トリプレットがアミノ酸を指定するということが納得され、4種の塩基の組み合わせで64個のトリプレットでき、20種類のアミノ酸を個別に指定できる暗号 (コドン) として使える十分な数を与えることがわかった。筆者は、フィル・リーダーが考え出したこのアッセイシステムに感動した。それまでポリマーとして扱っていたRNAを分解して、塩基配列のハッキリした短いオリゴヌクレオチドへ分別・精製して、システムを単純化し、結合に必要な長さと配列を突き止めた探求姿勢に感動するとともに、AA-tRNA・トリプレット・リボソームを、ミリポアフィルターで分取するアッセイ方法を編み出したことにも感心して唸ってしまう。ニトロセルロースを素材として0.45 μｍの小穴を持つ膜がどうして選ばれたのか、その裏には色々エピソードがあると思うが、とにかくそれは大成功だったし、その後、ミリポアフィルターも有名になった。学生時代に、筆者もこのアッセイを経験したが、誠に使い勝手の良い方法であった。曖昧な試薬を使って、右へ倣えの実験をやっているだけでは、曖昧なデータしか出てこなくて、役に立つ発見はないという教訓がここにはあるように思う。
日本発の酵素の功績
ミリポアフィルターもそうだが、もう一つ、ニーレンバーグとリーダーにこの快挙をなさしめたものがある。それは、この時までに、東京大学の江上不二夫・高橋健二博士らによって発見され、三共株式会社 (現第一三共(株)の前身) から売られていたリボヌクレアーゼＴ1 (RNaseT1) である。RNaseT1は、厳密にグアニル基の３'側でRNAを切断する酵素である117。この素晴らしい酵素は、後にアラニンAA-tRNAの全構造を決定してノーベル賞を得たR.W. Holly118へ送られーーー彼の手放せないーーー 最も重要な試薬だったが、このRNaesT1が無ければリーダーも塩基配列の判ったトリプレットを得ることができなかった。あとで述べるKhorana研へもRNaseT1は送られていて、この酵素が無ければRNAコドンの解析はしばらくなかったと思わざるを得ない。そんなことで、筆者は、Made in Japan の RNaseT1と高浪先生のtRNA/リボソームの研究がコード解読に果たした功績を高く評価したい。筆者が、mRNAの5’末端にキャップ構造を発見した時5,6,7、P1ヌクレアーゼ (ヤマサ醤油㈱株式会社で発見・販売) が119ーーー無くてはならない試薬であったことを思うとーーー、日本の底力がRNAの諸発見を支えてきたことを見落したくない。
今からでも遅くないーーーゴービン・コラーナ (H.G.Khorana) と西村暹博士
ニーレンバーグとリーダーの衝撃的なScience論文を皮切りに、トリプレットコドンの解読に関する多くの論文が、機関銃を打つように、NIHから論文が発表されたが、それらは、「コドン＝アミノ酸を指定する単語」であり、メッセンジャーRNA上の単語の並び方や、その読み方すらも判らなかった。たとえば、バリン (Valine) のコードは5’-GUU-3’とわかったが、それは、逆のUUGと読むのか、隣のコドンと重複してはいないかなど、「単語から文章」へのつながりが、まだわかっていなかった。また、PNPaseで作ったRNAを分解してトリプレットを精製するには作れるコドンの種類には限界があった。
この問題へ挑戦したのは、DNA合成研究で知られるウイスコンシン大のコラーナ研究室だった。主任のコラーナ教授は中肉中背のインド人。イギリスやヨーロッパで教育を受け、1960年からウイスコンシン大へ移り、DNA合成を基盤とする遺伝子の研究に取り掛かっていた。ここへ、1961年から米国テネシー州Oak Ridge 国立原子力研究所へ留学し、２年間のtRNA研究を終えた西村暹博士 (現RNA学会名誉会員) が、1963年10月から加わった。先のPNAS/Science論文が発表される8カ月前である。ニーレンバーグ研究室からの論文を読んだKhorana 教授は、1964年のある日、スタッフを集めて言ったーーー「いまからでも、研究室の総力を挙げれば、64個全てのトリプレットを化学合成し、誰よりも早くアミノ酸コドン全てを決めることができる。今やっている実験の手を止めて、協力してほしい」とーーー（いいね、こういうムチが入るような意思表示は）。
西村先生が以前書かれた「遺伝情報解読の瞬間にいて」(蛋白質・核酸・酵素 (2006), Vol51, 815~821) というエッセイを読むと、その臨場感が非常によく判る。なかに集合写真があって、Khorana先生を囲んで全員白衣の19名が写っている。この19人の研究者軍団には、第16話のバイサルファイト法の発見で紹介した早津彦哉博士や、北海道大学 (薬) から留学されていた大塚栄子博士が入っていて、真に強力だった。また、Khorana先生の偉大な統率力には敬服する。それは何処から来るのだろうか？ーーー、研究レベルでは、ボスが集中して、細かにDiscussionに向き合い、論文発表を進めることがその一つの要因だと思うが、Khorana先生は実によく書いている。
実際のところ、それから１年ほどで、64種類のトリプレット・オリゴについて、ニーレンバーグ・リーダー法によるリボソームへのAA-tRNA結合アッセイが終了し、現在、教科書で眼にするアミノ酸トリプレットコード表の原型がKhorana研から発表されている120。
表2：Khorana研究室からのゲノムコード予想 (1965120)。
この他、コラーナ研究室では、一定の塩基配列を持ったDNAオリゴを合成することができたので、それを鋳型にしてRNAポリメラーゼでRNAを作り、大腸菌の無細胞蛋白質合成系に入れて遺伝情報を調べる、いわゆる正攻法の戦略もとれた。この時、短いpoly d-TC やpoly d-ACのような２種のヌクレオチドからなる比較的短いDNAが大塚栄子博士らにより作られていて、スタンフォード大のポール・バーグ (Paul Berg) らにより、二本鎖にしたpoly d-TC : poly d-AGは、大腸菌のDNA依存性RNAポリメラーゼにより読まれ、反復配列を持つRNAが作られることが判っていた。西村博士は、翌年5月には日本へ帰国して、国立がんセンターへ着任することが決まっていて、1年足らずの有余期間しかなかったのであるが、コラーナ研究室にはこれまでになかった「DNA--> RNA--> 蛋白合成」による新Codon-decodingシステムをセットアップする、いわゆる生化学的アッセイ法の確立という大役を仰せつかっていた。
先のエッセイの中にはその苦労の数々が書かれているが：
poly d-TC : poly d-AG ――＞RNAポリメラーゼ (UTP ＋CTP) ――＞poly UC
――＞RNAポリメラーゼ (ATP ＋GTP) ――＞poly AG
でRNA合成を確認し、次のタンパク合成反応で、
poly UC (=UCU・CUC・UCU--) ――＞ Ser・Leu・Ser・Leu―――Ser・Leu
poly AG (=AGA・GAG・AGA--) ――＞ Arg・Glu・Arg・Glu―――Arg・Glu
他にも、poly d-TG: poly d-AC ――＞ poly UC + poly AG ――＞ Val・Cys, + Thr・His のコーディングを証明するだけでなく、「トリプレットコドンはオーバーラップしない」という重要なルールを確認したのである。西村博士は、これらの数々の発見に大車輪の活躍で、帰国前の6ヵ月で7報の論文を発表されたという121,122。このような、コラーナ研からのーーー「地道な」核酸化学を基盤にしたーーー大攻勢には、「ひらめき」のニーレンバーグ・リーダーのグループはさぞや驚いたことであろう。帰国直前の1965年、西村博士はKhorana博士とアトランティックシティーで開かれたFederation Meetingへ出かけ、それら最新データを発表しているが、座長は競争相手のニーレンバーグ博士だったという。
そんな研究競争の末、ついにゲノムコードは解読され、1968年のノーベル生理学・医学賞は、ニーレンバーグ、コラーナとtRNAの構造を初めて解析したホリー博士に与えられている。一方、Khorana研への西村博士の登場は、西部劇映画の「シェーン」に似ている。
世紀の研究競争に遭遇し、大車輪の活躍で問題を解決して、一人で、大平原へ、去って行くなぞ、とてもカッコいい。ただ、西村先生がガンマンのシェーンと違うのは、Khorana研に生化学技術を残すと共に、若いドイツ人ポスドクのDieter Sollを啓蒙し、この後にヨーロッパの代表的な核酸研究者になる有能な素材に、懇切な教育を施して育て、その後も永く交誼を結んだことであろう、などと筆者は思っている。
あとがき
先の19話を読まれた西村先生から、「君、ゲノムコード解読に関わったのは、NIHのニーレンバーグだけではないよ」という辛いコメントを頂いたので、1960年頃に戻って、多くの研究者の努力による「大河ドラマ・ゲノムの解読」を念頭に、文献を遡って読んでみた。1958年のグルンバーグ・マナーゴのPNPaseに始まる発見の連鎖についてはすでに記したが、その後の10年間にわたるコード解読については非常に多くの人がかかわっていることを感じていたので、筆者は恣意的に逃げていたのであるが、ついに、西村先生につかまってしまった感がある。
この稿で紹介した発見やそれに携わった方達は、私の年齢に近い先輩たちであり、遠慮もあって、気が重かったのであるが、論文を読み進んでいくと、後に、別のことで親しくなる友人達が、ポスドクの若い頃に、ゲノム解読という大きな渦の中でもがいていたのだということも判って来て、とても懐かしく思っている。
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