Cell誌の論文から
1981年の3月、研究所のランチョンセミナーの順が廻ってきて、筆者は、話題提供のセミナーをすることになった。ロシュ分子生物学研究所は3つの研究部があり、それぞれが、1フロアを占めていて、各階には大きな図書室があり、セミナーはそこで行われる。聴衆はポスドクやラボチーフなど50人ほどで、ランチョンの時は皆がサンドイッチとコーヒを持って集まり、一時間ほどのセミナーを楽しむ。セミナーのタイトルや発表者は、2週間ほど前に張り出される研究所のカレンダー上で予告されていて、この昼の時間帯は、訪問者が来て話す場合もあるし、内部のものが話す場合もあるが、いつも活気があった。
私が選んだ話題は、コロラド大学の トムCech（チェク）を中心とするグループが、１か月ほど前にCell誌に発表した不思議な現象だった84,85。それはテトラヒメナという繊毛虫のリボソームRNA前駆体中にある小さなインサートRNAに関するもので、スプライシングを受けて切り出され、そして、それがサーキュラー（輪になっている）という報告だった。のちに、トムCechはこの不思議な現象の観察からスタートし、RNA自身が触媒活性を示すことを証明し、RNAが酵素のように働くリボザイムと言われるRNA触媒分子の概念を打ち立てことになる。そして、1989年、シドニーAltmanと共にノーベル化学賞を受賞することになるのだが、その折の、私のセミナーは、ロシュ分子生物学研究所のランチの人には受けなかった。集まった人達は、がん細胞や、メッセンジャーRNAの話や、キャッピングや、ウイルスの話を期待していたのだろうが、テトラヒメナのリボソームRNA中に見出された、生物活性があるとも思えない小さなRNAのスプライシングの話なぞは、Cell Biology部の面々には、―――全く、面白くなかったのだ。
ただ、２年ほど経って、トムCechの名声があがり、リボザイムの話が出た時などには、この時のセミナーを思い出して「あの時の、お前の、あのセミナーはーーーあれは、凄い発見の予告だったんだなあ」 という友人が何人も出て来たので、そのことは申し添えておきたい。
夜中の電話
セミナーはあまり受けなかったが、この現象は私の頭から離れなかった。そこで、私はある夜、コロラド大のトムCech研究室へ電話してみた。ニュージャージー州ナトレーからコロラド州ボールダーへは、約2時間の時差がある。電話番号を知っていたわけでもないが、コロラド大学の電話交換手の女性に協力してもらって、学内名簿で探してもらった。そして、ある夜、ようやく化学部のトムCechに辿り着いた。私は自己紹介をして、彼のCellの論文に興味があると話した。トムは准教授で、私より7歳年下であることが判った。それまで会ったことはなかったが、明るい声の青年だった。幸い、トムは、私のキャップの仕事を知っていて、我々はお互いに、RNAの構造に興味があることがわかり、すぐによい話し相手になった。夜の10時に電話するとコロラドは8時頃だ。そんななことで、テトラヒメナの奇妙なRNAスプライシング現象のメカニズムや生物学的意議をどう攻めたら解決できるのかについて、私は彼の「謎解き作業」に加わることになった。何夜にもわたり話をした。それが、今となってはとても懐かしい。何しろ36年前の話だ。
この稿は、「走馬灯の回転」を、1981年のある時期の6か月間ほどに止めて、トムCechのリボザイムの発見の裏話を紹介したい。――とはいうものの、筆者は、論文を読んでーー面白いからといってーー未知の著者へ電話したことは、後にも先にも、この時以外にはない。多分、彼のCell論文に、なにか不思議な発見の匂いを感じたのかもしれない。
リボソームRNAのスプライシング
テトラヒメナのリボソームRNAは、最初に前駆体である35Sの長いRNAが、リボソ―ム遺伝子DNAから転写される。そして、35SのRNAはエンドヌクレアーゼによりプロセシング（裁断）を受け、26S、17Sと5.8Sの3つのRNAフラグメントに分断される。この3種のRNAフラグメントは、それぞれ、核小体内でリボソーム蛋白と結合して、リボソーム粒子のしかるべき場所へ取り込まれる。トム達は、3種のRNAのうちの26S RNA中に余分な小さなインサートRNAがあり、それが、RNA合成後に放出されるということを突きとめていた（文献１＆２）。この現象を発見したのは、テトラヒメナthermophilia菌についてだったが、トムのグループが初めてではない。トム以前に、Yale大学のWildとGallという二人の研究者が、別のテトラヒメナpigmentosa菌の26SのRNA中に小さなインサートRNAが入っていることを報告していた86。この小さなRNAは、テトラヒメナの菌種によって有るものと、無いものがあるが、生物学的にはインサートRNAの有無に関して、優劣の差はない。どちらの種でも、完成したリボソーム中には、この小さなRNAは抜けていて、無いのである。では、この小RNAは、一体、何をしているのであろうか？それが不思議だった。
成功したデングラ実験
スプライシングという現象については、すでに数年前に、フィルSharpやリッチRobertsの発見によって、mRNAの中の一部がループアウトして除かれるという驚きの洗礼を受けていたので、リボソームRNAにもスプライシングがあると聞いても驚くことはなかった。mRNAのスプライシングには多くのタンパク質が働いていることが判っていて、当時、その同定に多くの人がからんで、研究は進んでいた。さて、テトラヒメナのスプライシングされる小RNAのサイズは、0.4Kbであり9S RNAと呼ばれている。この9S RNAは、ゲル電気泳動では早く動くので、スプライスされたかどうかは、RNAを抽出して電気泳動をすればすぐわかる。ちなみに、リボソーム中には5S RNAという小さなRNAもあるが、こっちの方は、電気泳動ではもっと早く移動するので区別できる。しかし、35SのリボソームRNAの合成に応じて9S RNAが出現するという現象は、状況証拠ばかりのデータであり、本当に26S RNA中から、35S RNA―＞26S RNA－＞9S RNAの順にスプライスされて、出てくるのか確信が持てなかった。
直接的な証明が出来ないという、―――生みの苦しみというかーーーほんとに苦しい状況だった。リボソームRNAの遺伝子は何十個もタンデムに並んでいることが判っているので、いろんな可能性があり、仮説を絞り込むことも難しかった。
そんな折、トムと電話で話しているうちに、30℃で作られた9S RNAと、39℃で作られた9S RNAは、電気泳動の移動度が多少違うことがわかった。それは2次構造のせいだろうか、あるいは単にRNA分子がリニア（直鎖状）からサーキュラー（環状）へ変わったせいなのかーーーあるいはまた、何かアミノ酸でもついているのではないかーーー、そんなことで、電話でのDiscussionは次第に、RNA構造の深みにはまっていった。筆者は聞き役で、時折、アドバイスめいた指示を出していたが、トムと彼のグループはきちんとフォローしていた。時折、彼との会話の中にカリフォルニア工科大のジョンAbelsonの名前が出て来たから、トムが、RNA研究では経験豊かなジョンともこの不思議なRNAについて相談していることが察知された。
9S RNAをスプライスによって26S RNAから効率よく放出させるための条件を、いろいろ探っているうちに、ついに一つの実験が大当たりした。それは、スプライシング途中の中間体RNAを、しょ糖密度勾配超遠心分離（sucrose density gradient centrifugation：通称デングラ）で精製するということだった。後に発表された論文からわかるが、「Beckman SW41 rotor、36000rpm、4℃、11.5 hr」という条件や、「ヤマサ醤油のP1ヌクレアーゼによる分解など」、筆者が大好きな実験条件であり、これらは私のアドバイスの痕跡かなと思うと、とても懐かしい87。
驚きの発見 You are kidding!
トムとの夜の電話が最高潮の興奮に達したのは、彼から、スプライシングの途中の中間体RNAを転写反応液から取り出して、超遠心分離で精製したところ、（――SDS・フェノール処理によりーー）除タンパクした後でも、高分子の中間体RNAには、9SのインサートRNAを放出する能力があると聞いた時だった。これには驚いた。私は、思わずYou’re kidding!（冗談だろう）と言った。すると、トムは言った「そう、皆、そう言うんだ、でも、それに反論できないから困っている」―――と。
「RNA自体が酵素活性を持って、自己スプライシングしているように思えるんだ」。このトムの突飛な発言には本当に驚いてしまった。私も、――そして、数日前までは、彼自身もーーこの奇妙な、スプライシング反応が、酵素により行われていると確信してやまなかったのだが、ようやくそれが錯覚であったことに気が付いた。
つまり、この小さな9S RNAは、酵素の助けを受けることなく：
①自分自身で、26S RNAからスプライシングを行って26S RNAから離れ、
②このときできた26S RNA中の穴をふさぎ、
③そのあとは、自分自身でリニア状のRNAをサークル状に変えていたのだ。
私のような、古典的な「タンパク性の酵素触媒」の概念から抜け出せないものにとっては、この夜の電話は宇宙人と話しているようでもあった。以前、ボブKrugが「グロビンmRNAをインフルエンザウイルスの転写反応液へ入れたら、ウイルスmRNAの合成が100倍近くも増加した」と言った時と同じ程度の大きな驚きだった。
酵素タンパクは、立体構造を利用して、化学反応を触媒し、反応速度を速めるのだが、この9S RNAは、何故か、自分自身にその立体構造を備えているとしか思えない。トムは、除タンパクした中間体RNAを集め、ゲル電気泳動を使って、①〜③の反応に必要な条件をすでに探索していた。
1. ①と②には、低濃度の1価イオンとMg2+，それにGTPなどグアノシンを持つヌクレオチドが必須であることがわかった。
2. ③のためには、39℃で加温するのが良い。
3. GTPの代りに、キャップはどうかということで、私は、m7Gやm7GpppGなど、キャップに関連するヌクレオチドを、数日後、コロラドへ送ったが、どれもグアノシンやGTPのように、スプライシング反応を促進することが判った。グアノシンのリボース中の2’, 3’位OHがフリーなら、良いらしいのである。
後日、GTPは、9S RNAが26S RNAから切り出されるときに、その5’末端に、キャップをかぶせるように、pppG-9SRNAとして結合し、RNAがサークルになる時には、外れることも判った。何ということだろう！小さなRNAが、酵素の助けなし、でこんなにも複雑な反応を“自己スプライシング”でやってのけるのだ（図1）。
図1：テトラヒメナのリボソームRNAのリボザイム反応概念図
(a) テトラヒメナRNAのリボソームRNA遺伝子。赤色部分が407塩基のリボザイム・イントロン領域を示す。
(b) 26Sリボソーム前駆体RNA。GOHはグアノシン（GTPでもよい）を示す。
(Weaver textbookから、一部転載)
リボザイム
トムと彼のグループはこの小さなRNAにリボザイム（Ribozyme）という名前を付けた。リボース（Ribose）と酵素（Enzyme）の両方の言葉から作られたハイブリッド名だ、素晴らしい名前だと思う。リボザイムはRNA分子を特定の部位で切断したり、低分子の物質と特異的に結合する能力を持つので、医科学の領域や材料工学の分野での応用が期待される。トムCechはこのリボザイムの発見で1989年ノーベル賞化学賞を受賞し、その後2000年から2009年まで、ボストンで、ハワードヒューズ医学研究所所長の要職をつとめたが、現在は、教育やベンチサイドの研究生活がよいということで、コロラドへ戻っていると聞く。そういう話は、筆者は、大好きだ（図2）。
図2: トムCech博士(ネットから転載)
我々二人の夜の電話は、トムの研究が五里霧中だった1981年の中頃の6か月間ほどであったろうか。教科書では、リボザイムの発見は1982年となっているから、彼がこの期間中に得たRNAの自己スプライシングのアイデアは、リボザイムの発見に決定的なものであったに違いない。もし聞き役としての私が、何らかのキッカケを与えたのではあれば嬉しいことであるし、何よりも私自身が、RNAの機能に関する新発見を近くで味わえたことはラッキーであった。
リボザイムの応用について、富山大の井川善也教授に聞いてみたが、まだ“はかばかしい応用”は無いようである。井川さんがさきがけ研究時代からやっているリボスイッチにこそ、応用を期待したい。一方、リボザイム現象の発見から、―――はるか古代に、DNA時代の前にRNA時代があり、RNAが自己複製するために情報機能と触媒機能の二つの機能を兼ね備えていた“RNAワールド”の時代があったのではないかという壮大なロマンが作られた。たしかに、人間の世界では、石器時代から鉄器時代へ移ったように、RNA触媒は、より精緻で反応速度の速いタンパク性の酵素触媒に、後年、とって替わられたのではないかと思うフシ――つまり、リボザイムの反応速度は速いとは言えない――が、トムのCell論文からも感じられる。
エピローグ
リボザイムによる反応といい、インフルエンザのCap拉致反応といい、GTPが必須な反応がRNA関連では多いことに気が付く。私が発見したm7Gキャップも、もとはといえばGTPであり、CappingのあとにS-Adenosylmethionineによりメチル化されたものだ。何故だろう。あらためて、GTPの生化学領域における守備範囲の広さと、特異性には驚かされる。
この稿を書いている最中に、もと東大医科研所長の新井賢一さんが急逝されたという悲報が飛び込んできた。新井さんは、ともに上代教授門下生として、また米国に共通の友人を多く持つ友として、私にとって大切な人だった。その新井さんの若い時の出世作の研究は、大腸菌のタンパク合成の伸長因子EF-Ts & Tuの発見であり、これらもGTP結合タンパクだったことを思い出している。ご冥福を祈りたい。
もうひとつ、このエッセイの途中でジョンAbelsonの名前が出てきたが、ジョンAbelsonとは、私が東大薬の大学院博士課程を終えて国立遺伝学研究所に移ったばかりの時に会っているので、トムからジョンの名前を聞いた時には、懐しかった。キッカケは、当時から先見的なRNA研究者で、国立がんセンター研究所の部長だった西村暹先生が、「日本のRNA研究技術の興隆」のために、米国の若いRNA研究者3人を日本へ招聘して、「2次元電気泳動によるRNAオリゴの分析技術」の講習（実習）会をがんセンターで開かれたことだったように思う。筆者は関谷剛男さん（現佐々木研究所所長）と一緒にこの会へ出て、講師として来ていたジョンAbelsonやジムDahlberg（共に、現在米国アカデミー会員）に教わり、彼等の強烈な研究意欲を感じることができた。当時はまだ、日本は、研究後進国と思われていたので、3人の若い米国研究者（3人目は誰だったか、今もって思い出せない）がやってきて、RNA研究技術を教えに来てくれたことがあったことを思い出したので一筆残しておきたい。あれは、確か1970年だから、今から48年前のことである。日米双方の、実験指導者も受講生もほぼ同じ歳だった。日米のRNA研究には、そんな時もあったのだ。交流の盛んな昨今であるが、相互に、実験手技などを教わる機会などあるだろうか？
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