本プロトコルは哺乳類培養細胞におけるribosome profilingの基本プロトコルです。HEK293T細胞を想定して記述していますが、経験上同様の手法が他の培養細胞でも適用できることが多いです。

ribosome profilingに関する相談、質問、コメント等あれば岩崎(shintaro.iwasaki [at mark] riken.jp)までご一報いただければありがたいです。Citationはこちらです(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28579404)。

BASIC PROCEDURE

サンプル4本の場合

1. Lysate作製

【シクロへキシミド処理】

上記のバッファーを作製し、冷やしておく。
以下の試薬を使用直前に加える。

1. 10 cmディッシュの細胞を冷PBS 5 mlでリンスする。
2. PBSをよく吸い捨て、Lysis bufferを400 ul入れて全体に広げる。
3. ピペッティングで細胞を剥がし、DNA Lobind チューブに移す。Lysis buffer 200 ulで洗い込む。
4. 2 U/ul Turbo DNase I　7.5 ul 加え、氷上に10 minおく。
5. 20,000 g 4℃ 10 min
6. 上清をチューブに取り、転倒混和する。
7. 濃度測定用5 ul 1本、残りは100 ulずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し-80℃で保存する。

PAUSE POINT -80℃

【RNA濃度測定Qubit RNA BR Assay Kit】

1. Working Solution 200 ul　×（スタンダード用　2 本＋サンプル　4本分）を用意する。Working Solution＝Qubit RNA BR Reagent 1 ul : Qubit RNA BR Buffer 200 ul
2. 0.5 mlチューブにスタンダード用190 ul 、サンプル用199 ulずつ分注。スタンダード試薬#1,#2を10ul、サンプルを1ulずつ加え、ボルテックス、スピンダウン。室温で2 min 置く。
3. Qubit 2.0 Fluorometer で測定、RNA BR Assayを選択。スタンダード、サンプルを測定する。

＊80% confluentのHEK cellで10 cmディッシュ1枚から200-300 ng/ulになる。（600 ul lysateの場合）

2. RNase消化〜超遠心〜リボソームの精製

・ヒートブロック　25℃準備
・超遠心機のローター冷やしておく

Sucroseが溶けたら氷上で冷やしておき、使用直前に以下を加える。

【サンプル準備】

・Rnase Iは　2 U/1ug RNAで使用する。（RNA 10 ugの時20 U使用）

1. チューブにRNAをとり、Lysis bufferで298 ulにする
2. RNase Iを2 ulずつ入れ優しく混合、ヒートブロックで25℃　45 min(サンプル間で反応時間に差が出ないよう正確に).
3. 氷上へ移して、すぐに SUPERase In (RNase inhibitor)を10 ulずつ加える。 (冷やすことで反応止める効果があるので先に氷上へ)
4. 超遠心チューブにRNaseI消化後のサンプル300 ulを移す。
5. Sucrose cushion buffer 900 ulをサンプルの下から２層になるようゆっくり注ぐ。
6. TLA110 ローターで、100,000 rpm　4℃　1 h
7. ペレットを崩さないよう、上清を液面の上部から吸い捨てる.
8. ペレットにTRIzol reagent を300 ul入れて(ペレットが見えるようになる)よく溶かす。
9. DNA Lobindチューブに移す。

PAUSE POINT -80℃

【Direct-zol MicroPrep kit カラム精製】

1. カラムに移して12,000 g, 1 min, 4℃. 受けチューブは1回ごとに使い捨てる。
2. PreWash buffer 400ul を加え12,000 g, 1 min, 4℃.2回行う
3. Wash Buffer 700 ul, 12,000 g, 1 min, 4℃.
4. 空遠心　12,000 g, 5 min, 4℃.
5. RNase-free waterを6 ul を加え　12,000 g, 2 min, 4℃.
6. 2x RNA Loading Bufferを6 ul加える

PAUSE POINT -80℃　

3. Footprint Fragment 精製

【RNA サイズマーカー準備と泳動】

1. RNA サイズマーカーとサンプルをヒートブロックで95℃　3 min　→　氷上　2 min　
2. WAKO SuperSep RNA 15% ゲルを用意　
3. well掃除を行ってから、サンプルをアプライする。コンスタント10 mA で50 min泳動する。　
4. 1 x TBE　50 ml + SYBRGold 5 ul (10,000倍希釈)でゲルを染色する。シェーカーで揺らしながら3 min　
5. ブルーライトに乗せて、バンドを確認しサンプルの26bp-34bpの間を切り出す。　
6. マーカーも切り出しておく。

【gelからのRNA抽出】

1. 1.5 mlチューブに入れたゲル片をペッスルで潰す。
2. RNA gel extraction buffer 400 ulを入れ、ペッスルについたゲルを洗い込む。
3. −80℃, 30 min or 液体窒素で凍結する。
4. 室温 2 h以上転倒混和する。
5. Spin-XカラムをDNA Lobind 1.5 mlチューブにセットし、先太チップでゲル溶液を移す。
6. 10000 g, 1 min, 4℃　
7. GlycoBlue 3 ul , イソプロパノール500 ulを加えよく混ぜる。
8. 冷凍庫に1 h入れた後、20,000 g, 30 min, 4℃.
9. 上清を捨てて、70% エタノールリンス
10. ペレットに10 mM Tris pH7.5を7 ul入れ、溶かす。

PAUSE POINT -80℃

4. 20 uM Preadenylylated linker 作製

1. 以下の溶液を8連チューブに調製する。

65℃　1 h → 85℃　5 min

2. Oligo clean & Concentrator カラム精製

カラムに移して12,000 g, 1 min.
Wssh buffer 750 ul を加え、12,000 g, 1 min.
空遠心 12,000 g, 5 min.
RNase-free water 6 ulでElution.

PAUSE POINT -20℃

5. Dephosphorylation and Linker Ligation

【脱リン酸化】

1. Mixtureの準備　マーカー + サンプル４つの場合

2. サンプルは8連チューブに移し、95℃2 min → 氷上3 min
3. mixtureを3ulずつ分注し　37℃　1 h

PAUSE POINT -80℃

【リンカーライゲーション】

・サンプルごとにそれぞれ別のリンカーをつける。メモしておく。
・マーカーにはどのリンカーをつけても良い

1. 脱リン酸化後　95℃2 min → 氷上3 min

2. サンプルに9 ulずつ分注
3. Preadenylated linker (20 uM)を1 ulずつ分注　mix
4. 22℃　3 h　→　4℃　∞
5. Oligo clean カラム精製(前述の通りに精製)する。
6. Elution 6 ul + 2 x RNA Loading Buffer 6 ul

PAUSE POINT -80℃

【泳動準備】

① linker のみ

② Linker ligation後のマーカー
③ Linker ligation後サンプル

1. ヒートブロック　95℃　3 min　→　氷上　2 min
2. 前述の通りに泳動する。

3. Linker ligation後のサンプルとマーカーを切り出す。
＊切り出したサンプルはリンカーがそれぞれ違うので、以降は混ぜても良い。

4. gelからのRNA抽出(前述の通り)

〜70%リンス後ペレットを溶解時〜
次のRibo-Zero処理では４サンプルをまとめて処理する。全量が26 ulになるように、10 mM Tris pH 7.5で溶解する。
マーカーはRibo-Zero処理しないので、10 mM Tris pH7.5を10 ulで溶解する。

PAUSE POINT -80℃

6. Ribo-Zero処理

1. ビーズを225 ul チューブに移し、マグネットに立てる。
2. 上清を捨てて、RNase-free water 225 ul で2回洗浄する。
3. Resuspension solution 60 ulで懸濁する。室温においておく。
4. 1.5mlチューブに以下の溶液を作製。

68℃　10 min　→　室温　5 min

5. 用意しておいたビーズ65 ulを入れピペッティング、vortex 10 s。室温で5 minおいた後vortex 10 s、マグネットに立てる。
6. 上清を新しいチューブに移す。
7. Oligo clean & Concentratorカラム精製を行う。

(カラムには800 ulまでしか入らないので、2回に分けてカラムに通す)
前述の通りに精製し、RNase-free water 10 ulでElution。

PAUSE POINT -80℃

7. 逆転写反応

1. 8連チューブに以下のものを用意する。

① RT primerのみ (RNase-free water 10ul) or
② RT primer + linker (RNase-free water 9.5 ul + 20 uM liker 0.5 ul) or
③ マーカー（linker ligation後）10 ul or
④ サンプル（linker ligation、Ribozero後）10 ul

＋

1.25 uM RT primer NI802 2 ul
total　12 ul

65℃　5 min　→　氷上　5 min

2. mixtureを①〜④ + RT primerに8ulずつ分注する

3. 50℃　30 min
4. 1 M NaOHを2.2 ulずつ加え、混ぜる。70℃　20 min
5. Oligo clean & Concentrator カラム精製

RNase-free waterを28 ul足して50 ulにする。前述の通りに精製する。
Elution 6ul + 2x RNA Loading Buffer 6ul

PAUSE POINT -20℃

【泳動準備】

・リンカーとRT primerがアニールしたものがサンプルサイズと重なるため、ヒートブロックで100℃　5 min　→　氷上においてから泳動する。

DNA gel extraction buffer（泳動の間に作っておく）

・切り出したゲルはDNA gel extraction bufferを入れDNAを抽出し、前述の通りにイソプロ沈を行い、ペレットに10 mM Tris pH7.5を12 ul入れ溶かす。

8. Circularization

1. mixtureを8連チューブに8 ulずつ分注する。

2. サンプルを12 ulずつ分注する
3. 60℃　1 h　→　80℃　10 min

PAUSE POINT -20℃

9. PCR Amplification and Barcode Addition

・サンプルはサイクル数を振って（6 ,8, 10サイクル）、非特異バンドが少ないバンドを切り出す。
・コントロール① RT primerのみ② RT primer + linker ③ マーカー（inker ligation後）は8サイクルのみでよい。

1. サンプルは反応液100 ulを作り、33 ulずつ3つのwellに分ける（6 ,8, 10サイクル）

コントロールは100 ul 分のtemplateなし反応液作成、3つのwellに分け、templateを1.7 ulずつ加える（8サイクル）。
PCR後、ライブラリーをさらにpoolする場合は、ライブラリーごとに異なるRv primer (NI822-826)を必要に応じて用いる。
(poolできるサンプル数　= linkerバーコード X PCR primerバーコード)

2. PCRをスタートさせたら、各サイクルの伸長反応が終わったところでチューブを回収していく。

1) 98℃ 30 s
2) [98℃ 10 s, 65℃ 10s, 72℃ 5 s] x6, x8, x10（になるよう2サイクルずつ回収する）
3) 72℃ 5 min
4) 4℃ ∞

PAUSE POINT -20℃

10. PCR productのゲル精製

PCR productはdenatureさせてはいけない。ゲルはSuperSep DNA, 15%を使用する。 Loading Dyeは6 x non-denaturing purple loading dyeを使用する。

【泳動準備】

・サンプル33 ul + 6 x non-denaturing purple loading dye 6.5 ul を混合し、2 wellに19 ulずつ泳動する
・RT primer, linker, Marker 33 ul + 6 x non-denaturing purple loading dye 6.5 ul を混合し、2 wellに10 ulずつ泳動する
・20 mA　1 h 20min泳動し、前述の通りにゲル染色する
・最適サイクル数を確認して、バンドを切り出す

【gelからのDNA抽出】

1. 2 well分のゲル片をペッスルで潰し、DNA gel extraction buffer 230 ul入れる。
2. -80℃ or 液体窒素で凍結後、室温2 h以上転倒混和。Spin-Xカラムでゲル片を取り除く。
3. NucleoSpin Gel and Cleanカラム精製

4. カラムに移して、11,000 g, 1 min, 4℃.
5. Buffer NT3 700ul でWASH 11,000 g, 1 min, 4℃. x2回
6. 空遠心 11,000 g, 5 min.
7. NE buffer 17 ul 加え、室温 1 minおく
8. Elution　11,000 g, 1 min, 4℃.

11. Quality Check by MultiNA

【超高感度モードで測定】
※設定が必要なので島津に相談

・1/25 Gel Star（TEで25倍希釈したもの）
・1/5 島津マーカーDNA-1000（H₂Oで5倍希釈したもの）
・1/50 100 bp DNA ラダー（TEで50倍希釈したもの）

1. 分離Buffer の準備

2. サンプル、ラダーの準備

3. 機械にセットして測定
4. 濃度、mol数は結果を1/5した値になる。（超高感度測定のため）

シークエンスに必要な量は1 nM が15 ul分です。
足りない場合は最適サイクルのみを100ul分PCRし、同様にゲル精製を行ってください。
PCR Duplicateを減らすために、解析に出すサンプルはサイクル数の少ない方を優先します。サイクル数の違うサンプル同士は混ぜないでください。

Materials

l   HEK293 cells (ATCC, cat. no. CRL-1573)

l   DMEM (1x) + GlutaMAX-I (ThermoFisher Scientific, cat. no. 10566-016), with 10% FBS before use.

l   0.05% Trypsin-EDTA (ThermoFisher Scientific, cat. no. 25300-54)

l   Cycloheximide 100 mg/ml (Sigma/Aldrich, cat. no. C4859-1ML)

l   D-PBS (-)(1x) (nacalai tesque, cat. no. 14249-24)

l   RNase-free water, molecular biology grade (Millipore, cat. no. H20MB1001) or (ThermoFisher Scientific cat. no. 10977-015)

l   1 M Tris-HCl pH 7.5, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 318-90225)

l   5 M NaCl, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 06900-14)

l   1 M MgCl₂, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 20942-34)

l   Turbo DNase, 2 U/µl (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM2238)

l   Triton X-100, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 12967-32)

l   Qubit RNA BR Assay kit (ThermoFisher Scientific, cat. no. Q10210)

l   SUPERase·In, 20 U/µl (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM2694)

l   Sucrose, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 198-13525)

l   3 M NaOAc pH 5.2, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 06893-24)

l   RNase I, 10 U/µl (Epicentre, cat. no. N6901K)

l   13 x 56 mm polycarbonate ultracentrifuge tube (Beckman Coulter, cat. no. 362305)

l   Direct-zol RNA MicroPrep (Zymo Research, cat. no. R2062)

l   TRIzol (ThermoFisher Scientific, cat. no. 15596018) or other Direct-zol compatible reagent

l   Ethanol, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 054-07225)

l   Isopropanol, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 168-21675)

l   GlycoBlue, 15 mg/ml (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM9515)

l   0.5 M EDTA, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 311-90075)

l   2× RNA Loading Buffer without Ethidium Bromide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 182-02571)

l   SuperSepRNA, 15%, 17well (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 194-15881)

l   Upper size marker oligoribonucleotide NI800 (34 nt),
5´-AUGUACACUAGGGAUAACAGGGUAAUCAACGCGA-(Phos).

l   Lower size marker oligoribonucleotide NI801 (26 nt),
5´-AUGUUAGGGAUAACAGGGUAAUGCGA-(Phos).

l   10,000x SYBR Gold (ThermoFisher Scientific, cat. no. S11494)

l   UltraPure 10% SDS (ThermoFisher Scientific, cat. no. 15553-027)

l   T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, cat. no. M0201S). Supplied with 10x T4 polynucleotide kinase buffer.

l   T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q (New England Biolabs, cat. no. M0351S). Supplied with PEG 8000 50% w/v and 10x T4 RNA ligase buffer

l   Preadenylated linkers at 20 µM

l   Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, cat. no. D4060)

l   10 mM dNTP mix (New England Biolabs, cat. no. N0447L)

l   ProtoScript II (New England Biolabs, cat. no. M0368L). Supplied with 5x first-strand buffer and 0.1 M DTT

l   Reverse transcription primer, NI-802,
5´-(Phos)NNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG(iSp18)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC.

l   1M Sodium hydroxide (nacalai tesque, cat. no. 37421-05)

l   CircLigaseII ssDNA ligase (Epicentre, cat. no. CL9025K). Supplied with 10x CircLigaseII buffer, 5 M Betaine, and 50 mM MnCl₂.

l   Forward library PCR primer, NI-798,
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC

l   Indexed reverse library PCR primers,
NI-799,
5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

l   Phusion polymerase (New England Biolabs, cat. no. M0530S). Supplied with 5x HF buffer.

l   Gel Loading Dye, Purple (6×) (New England Biolabs, cat. no. B7024S)

l   SuperSep DNA, 15%, 17 well (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 190-15481)

l   DNA-1000 kit (SHIMAZU BIOTECH)

l   GelStar Nucleic Acid Gel Stain 10,000× (LONZA, cat. no. 50535)

l   100 bp DNA Ladder (TAKARA BIO, cat. no. 3407A)

l   NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (TAKARA, cat. no 740609.250)

Equipment

l   DNA LoBind Tube 1.5 ml (eppendorf, cat. no. 022431021)

l   8-strip PCR tube with lid (BIO-BIK, cat. no. 3247-00)

l   Nunc 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes (ThermoFisher Scientific, cat. no. 339652)

l   Eppendorf Tubes 5.0 ml (eppendorf, cat. no. 0030122313)

l   Low retention filter tips (greiner bio-one, cat. nos. 771265, 773265, 738265, and 750265)

l   Short 10 µl filter tips (watson, cat. no. 1252-207CS)

l   Wide Bore 200 µl filter tips (Axygen, cat. no. TF-205-WB-R-S)

l   Gel loading 20 µl filter tips (ThermoFisher Scientific, cat. no. 2155P)

l   Refrigerated microcentrifuge (TOMY, cat. no. MX-307)

l   Qubit 2.0 Fluorometer (ThermoFisher Scientific)

l   Optima MAX-TL Ultracentrifuge (Beckman, cat. no. A95761)

l   TLA 110 rotor (Beckman, cat. no. 366735)

l   Dry block heater (Major science, cat. no. MC-0203)

l   EasySeparator (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 058-07681)

l   Electrophoresis power supply (Amercham Biosciences, cat. no. EPS301)

l   Blue light illuminator and orage filter cover (NA). A standard UV transilluminator can be used instead.

l   Razors (Feather, cat. no. FAS-10) or (Feather, cat. no. No 11 stainless steel)

l   Spin-X centrifuge tube filter 0.22 µM (costar, cat. no. 8160)

l   Thermal cycler (Applied Biosystems, cat. no. 2720)

l   DynaMag-2 separation rack (ThermoFisher Scientific, cat. no. 12321D)

l   MixMate (eppendorf)

l   MultiNA (SHIMAZU BIOTECH)

l   Disposable homogenizer pestle R-1.5 (ASONE, cat. no. 1-2955-01)

Custom Linker Barcodes

PCR Indexing Primers